Fortschritte auf dem Gebiet der Kryokonservierung von Drohnensperma

Im Vergleich zu Kolleginnen und Kollegen, die mit anderen Tierarten arbeiten, muss die Bienenzucht zusätzliche, erhebliche Schwierigkeiten überwinden, insbesondere:

• die Fortpflanzungsweise von Apis mellifera. Diese umfasst nur eine einzige Paarungsperiode, die auf wenige Tage begrenzt ist, jedoch für die Befruchtung der während des gesamten Lebens der Königin gelegten Eier ausreichen muss. Zu diesem Zweck beträgt die Anzahl der Spermatozoen in der Spermatheka künstlich besamter Königinnen etwa 3–4 Millionen, teilweise auch mehr;
• die kurze Lebensdauer der Königinnen: Die Bewertung des Zuchtwerts einer Königin erfordert mindestens ein Produktionsjahr. In der Regel bleibt danach nur noch eine einzige Saison, um sie als Zuchtkönigin zu nutzen.

Wäre es daher nicht interessant, die Allele der leistungsfähigsten oder wichtigsten Königinnen nach ihrem Tod zu erhalten? Es ist daher nicht überraschend, dass die Kryokonservierung von Drohnensperma seit den 1970er-Jahren Gegenstand der Forschung ist. Das Risiko eines Verlusts der natürlichen Biodiversität stellt eine weitere Motivation für diese Arbeiten dar. Es gibt nahezu dreißig Unterarten von Apis mellifera, von denen die meisten durch die Introgression importierten genetischen Materials bedroht sind. Diese „lokalen“ Bienen tragen jedoch Gene in sich, die möglicherweise Lösungen für zukünftige imkerliche Probleme bieten. Schließlich könnte die Kryokonservierung von Sperma ein wertvolles Instrument für die Zucht seltener Merkmale werden, wie etwa der Resistenz gegen Varroa. In solchen Fällen könnte sie die Zahl möglicher Anpaarungen erhöhen und damit den Inzuchtgrad begrenzen.

Im Gegensatz zu den meisten anderen Tierarten sind die Spermatozoen unserer Honigbiene von Natur aus für eine lange Lagerung ausgelegt – selbst bei Raumtemperatur bleiben sie mehrere Wochen lang lebensfähig und fertil, eine für Besamer äußerst nützliche Eigenschaft. In Zusammenarbeit mit dem Institut für Wildtierforschung in Berlin sowie der Universität Leipzig konnte das Labor in Hohen Neuendorf (Deutschland) zeigen, dass diese natürliche Langlebigkeit wahrscheinlich teilweise auf die Zusammensetzung der Zellmembranen zurückzuführen ist, die extrem arm an mehrfach ungesättigten Fettsäuren sind (Wegener et al., 2013). Die Qualitätsanforderungen an konservierte Spermatozoen sind jedoch höher als bei anderen Tierarten – eine mit konserviertem Sperma besamte Königin muss Tausende befruchteter Eier legen, und die aufgenommenen Spermatozoen müssen über lange Zeit in der Spermatheka lebensfähig bleiben.

Daher entwickelten sowjetische und später amerikanische Forscher in den 1970er- und 1980er-Jahren relativ rasch Methoden, um Drohnensperma bei der Temperatur von flüssigem Stickstoff (−196 °C) einzufrieren und anschließend lebend und teilweise sogar hochaktiv wieder aufzutauen (Melnichenko und Vavilov, 1975; Harbo, 1983). Nach der Besamung war jedoch die Anzahl der in der Spermatheka wiedergefundenen Zellen gering (in der Regel < 300.000), der Anteil an Arbeiterinnenbrut (Indikator für den Befruchtungsgrad der Eier) niedrig und die Lebensdauer der Königinnen häufig kurz. Neuere Verbesserungen der Methode durch Forscher der Universität Washington erhöhten diesen Arbeiterinnenanteil bei Königinnen, die mit aufgetautem Sperma besamt wurden, auf durchschnittlich 50 %, jedoch blieb die Lebensdauer der Königinnen sehr kurz (Hopkins et al., 2012). In Frankreich erzielte auch das INRA in Avignon in den 2000er-Jahren ermutigende Ergebnisse mit einigen Königinnen, die mit kryokonserviertem Sperma in Eiablage gingen. Leider funktionierte die verwendete Methode nicht zuverlässig.

Das Institut für Bienenforschung in Hohen Neuendorf befasste sich ab 2009 mit der Kryokonservierung von Drohnenspermatozoen, mit Unterstützung eines lokalen KMU (AMP-Lab GmbH) und des deutschen Landwirtschaftsministeriums*. Nach zahlreichen erfolglosen Versuchen stellten sich die Forscher die Frage, ob der sehr aktive Zustand der Spermatozoen nach dem Auftauen nicht problematisch sei. Bei anderen Arten ist bekannt, dass die Hyperaktivität der Spermatozoen nur kurzzeitig und unmittelbar vor dem Kontakt mit der Eizelle ausgelöst wird. Dieser hyperaktive Zustand ist in der Regel irreversibel, und aktivierte Spermatozoen überleben nicht lange. Die Befruchtung bei Bienen der Gattung Apis unterscheidet sich jedoch deutlich: Zum Zeitpunkt der Ejakulation bilden die Spermatozoen eine extrem dichte Masse (etwa 7 Millionen Spermatozoen pro Mikroliter!), in der lediglich parallele Wellenbewegungen der Flagellen von Spermienpaketen möglich sind (Abbildung 2). Alle „klassischen“ Methoden der Kryokonservierung beinhalten jedoch die Zugabe eines Verdünners zum Sperma, der Substanzen zur Verhinderung der intrazellulären Eisbildung (Kryoprotektoren) enthält. Die Verdünnung führt in der Regel zur Aktivierung der Spermatozoen und zerstört die meisten Pakete. Deshalb wurde eine alternative Methode zur Zugabe der Kryoprotektoren entwickelt, nicht durch Verdünnung, sondern durch Dialyse (Abbildungen 3–5). Dabei wird das Sperma in ein Röhrchen überführt, das in eine konzentrierte Kryoprotektorlösung getaucht wird. Das Material des Röhrchens lässt den Kryoprotektor passieren, jedoch keine größeren Moleküle oder Spermatozoen. So kann der Schutzstoff in das Sperma eindringen, ohne die Pakete zu zerstören. Zudem ermöglicht die Dialyse eine Reduktion des zellulären Wassers, wodurch das Risiko der Kristallbildung während des Gefrier- und Auftauprozesses verringert wird.

Mit dieser kürzlich in der Fachzeitschrift Cryobiology veröffentlichten Methode (Wegener et al., 2014) wurde ein Arbeiterinnenbrutanteil von in der Regel über 50 % erreicht, der über mehrere Monate aufrechterhalten werden konnte. Einige überwinterte Königinnen produzierten sogar im folgenden Frühjahr noch Arbeiterinnenbrut. Diese Ergebnisse erlauben zwar noch nicht den Einsatz aufgetauten Spermas zur Besamung von „Produktionsköniginnen“, sie reichen jedoch aus, um Königinnen mit gefrorenem Sperma zu besamen und zu erreichen, dass diese selbst befruchtete Eier produzieren. Dadurch können eingefrorene Allele wieder eingeführt werden. Die Kryokonservierung von Drohnensperma kann somit bereits heute für den Schutz der Biodiversität oder in spezifischen Zuchtprogrammen eingesetzt werden.

Im Jahr 2014 vereinfachte das Institut in Hohen Neuendorf das Protokoll erheblich und entwickelte ein kommerzielles Kit zur Kryokonservierung**. Der Prozess erfordert jedoch den Umgang mit flüssigem Stickstoff sowie einen kryogenen Behälter für die Langzeitlagerung. Eine solche Ausrüstung ist kostenintensiv, und ihre Nutzung setzt eine entsprechende Schulung voraus, um Risiken zu vermeiden. Aus diesem Grund wird interessierten Züchtern eher empfohlen, sich entweder an ein öffentliches Institut oder an eine kommerzielle Kryobank zu wenden.

In den Vereinigten Staaten wurde kürzlich eine erste Kryobank für Drohnensperma eingerichtet, die noch mit einem „konventionellen“ Kryokonservierungsprotokoll arbeitet, das heißt ohne Dialyse. In Europa laufen derzeit Diskussionen über die Einrichtung einer weiteren solchen Einrichtung. Ein derartiges Instrument könnte eine wichtige Unterstützung für die Erhaltung genetischer Ressourcen der Honigbiene sowie für die Arbeit der Züchter darstellen, beispielsweise mit dem Ziel, eine tatsächlich gegen Varroa destructor resistente Bienenlinie zu entwickeln.

 

* über die Bundesanstalt für Landwirtschaft und Ernährung im Rahmen ihres Innovationsförderprogramms (FKZ 2813500408).
** erhältlich unter www.amplab.de

 

Literatur

Harbo, J. (1983) Survival of honey bee (Hymenoptera: Apidae) spermatozoa after two years in liquid nitrogen (-196°C). Ann Entomol Soc Am 76, 890–891.

Hopkins, B.K., C. Herr, W.S. Sheppard (2012) Sequential generations of honey bee (Apis mellifera) queens produced using cryopreserved semen. Reproduction, Fertility and Development 24, 1079–1083.

Melnichenko, A.N., I.L. Vavilov Long term storage of drone sperm by freezing in liquid nitrogen. In: Apimondia, Prag, 1975. S. 311–314.

Wegener, J., K. Zschörnig, K. Onischke, B. Fuchs, J. Schiller, K. Müller (2013) Conservation of honey bee (Apis mellifera) sperm phospholipids during storage in the bee queen – a TLC/MALDI-TOF MS study. Exp Gerontol 48, 213–222.

Wegener, J., T. May, G. Kamp, K. Bienefeld (2014) A successful new approach to honeybee semen cryopreservation. Cryobiology 69, 236–242.

 

Hauptautor dieses Artikels ist Dr. Jakob Wegener, diplomierter Agraringenieur des Institut Supérieur Agricole de Beauvais. Er ist seit 25 Jahren Imker und arbeitet seit 12 Jahren am Institut für Bienenforschung in Hohen Neuendorf (Deutschland). Kontakt per E-Mail: wegenerj@hu-berlin.de.

Quelle: http://itsap.asso.fr/

---

Mehr erfahren:

• Besamung mit einem einzigen Drohnen: Stand der Praxis
• Alles über den Drohnen
• Die Drohnenzucht
• Aufzucht von Drohnen
• Prinzipien und Methoden der Königinnenzucht
• Merkblatt: 4.7 Völkerbeurteilung und Selektion